T4-DNA-Ligase
Die T4-DNA-Ligase ist ein Enzym aus der Gruppe der DNA-Ligasen und wird vom Enterobakterienphagen-T4 gebildet.[1]
Eigenschaften
Die T4-DNA-Ligase wird in infizierten E. coli zu Beginn des lytischen Zyklus des T4-Phagen gebildet. Sie erzeugt je eine Phosphodiesterbindung zwischen zwei aneinandergrenzenden DNA-Sequenzen in DNA-Doppelsträngen und dient den Bakteriophagen zur DNA-Replikation, Rekombination und zur DNA-Reparatur. Cofaktoren sind zweiwertige Magnesiumionen. Die T4-DNA-Ligase fügt sowohl blunt ends als auch sticky ends doppelsträngiger DNA, RNA und DNA-RNA-Hybriden zusammen, einzelsträngige DNA oder RNA jedoch nur in geringem Umfang.[2] Der Doppelstrang muss dafür mindestens 5 gepaarte Nukleinbasen aufweisen.[3] Eine durch Proteindesign modifizierte T4-DNA-Ligase, die als Fusionsprotein mit NFκB p50 erzeugt wurde, besitzt eine 160-fach erhöhte Enzymaktivität.[4]
Die T4-DNA-Ligase katalysiert die Reaktion:[5]
ATP + (Desoxyribonukleotid)(n)-3'-hydroxyl + 5'-Phospho-(desoxyribonukleotid)(m) (Desoxyribonukleotid)(n+m) + AMP + Diphosphat
Anwendungen
Die T4-DNA-Ligase wird im Zuge einer Klonierung oder einer künstlichen Gensynthese zur Ligation zweier DNA-Doppelstränge aneinander verwendet (mit 1 mM ATP und 10 mM Mg2+). Sticky ends werden dabei etwa zwölfmal schneller ligiert als blunt ends (10 min vs. 2 h). Eine thermostabile DNA-Ligase zur Verwendung in Polymerasekettenreaktions-basierten Methoden ist die Taq-DNA-Ligase aus Thermus aquaticus.
Literatur
- E. S. Miller, E. Kutter, G. Mosig, F. Arisaka, T. Kunisawa, W. Rüger: Bacteriophage T4 genome. In: Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. Band 67, Nummer 1, März 2003, S. 86–156, table of contents, PMID 12626685, Vorlage:PMC.
Weblinks
Einzelnachweise
- ↑ J. Armstrong, R. S. Brown, A. Tsugita: Primary structure and genetic organization of phage T4 DNA ligase. In: Nucleic acids research. Band 11, Nummer 20, Oktober 1983, S. 7145–7156, PMID 6314278, Vorlage:PMC.
- ↑ H. Kuhn, M. D. Frank-Kamenetskii: Template-independent ligation of single-stranded DNA by T4 DNA ligase. In: The FEBS journal. Band 272, Nummer 23, Dezember 2005, S. 5991–6000, Vorlage:DOI, PMID 16302964.
- ↑ D. R. Horspool, R. J. Coope, R. A. Holt: Efficient assembly of very short oligonucleotides using T4 DNA Ligase. In: BMC research notes. Band 3, November 2010, S. 291, Vorlage:DOI, PMID 21062485, Vorlage:PMC.
- ↑ R. H. Wilson, S. K. Morton, H. Deiderick, M. L. Gerth, H. A. Paul, I. Gerber, A. Patel, A. D. Ellington, S. P. Hunicke-Smith, W. M. Patrick: Engineered DNA ligases with improved activities in vitro. In: Protein engineering, design & selection : PEDS. Band 26, Nummer 7, Juli 2013, S. 471–478, Vorlage:DOI, PMID 23754529.
- ↑ I. R. Lehman: DNA ligase: structure, mechanism, and function. In: Science. Band 186, Nummer 4166, November 1974, S. 790–797, PMID 4377758.